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光度计的核酸定量的功能分析
发布时间:2020-05-20   点击次数:199次
  光度计的核酸定量功能分析
 
  核酸的定量是光度计使用频率高的功能。可以定量溶于缓冲液的寡核苷酸,单链、双链DNA,以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波长260 nm。每种核酸的分子构成不一,因此其换算系数不同。
 
  定量不同类型的核酸,事先要选择对应的系数。如:1OD 的吸光值分别相当于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。
 
  测试后的吸光值经过上述系数的换算,从而得出相应的样品浓度。测试前,选择正确的程序,输入原液和稀释液的体积,尔后测试空白液和样品液。然而,实验并非一帆风顺。读数不稳定可能是实验者头痛的问题。灵敏度越高的仪器,表现出的吸光值漂移越大。
 
  事实上,分光光度计的设计原理和工作原理,允许吸光值在一定范围内变化,即仪器有一定的准确度和精确度。如Eppendorf Biophotometer的准确度≤1.0%(1A)。
 
  这样多次测试的结果在均值1.0%左右之间变动,都是正常的。另外,还需考虑核酸本身物化性质和溶解核酸的缓冲液的pH值,离子浓度等:在测试时,离子浓度太高,也会导致读数漂移,因此建议使用pH值一定、离子浓度较低的缓冲液,如TE,可大大稳定读数。
 
  样品的稀释浓度同样是不可忽视的因素:由于样品中不可避免存在一些细小的颗粒,尤其是核酸样品。这些小颗粒的存在干扰测试效果。为了大程度减少颗粒对测试结果的影响,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值好在0.1-1.5A。在此范围内,颗粒的干扰相对较小,结果稳定。
 
  从而意味着样品的浓度不能过低,或者过高(超过光度计的测试范围)。后是操作因素,如混合要充分,否则吸光值太低,甚至出现负值;混合液不能存在气泡,空白液无悬浮物,否则读数漂移剧烈;必须使用相同的比色杯测试空白液和样品,否则浓度差异太大;换算系数和样品浓度单位选择一致
 
  除了核酸浓度,分光光度计同时显示几个非常重要的比值表示样品的纯度,如A260/A280的比值,用于评估样品的纯度,因为蛋白的吸收峰是280nm。
 
  纯净的样品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。A230表示样品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320检测溶液的混浊度和其他干扰因子。
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